ELISA實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法

　　ELISA實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳

可能原因 解決方法

倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)未混勻 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的每一步均需混勻

過(guò)早稀釋 標(biāo)準(zhǔn)品在快要使用時(shí)稀釋

加入的體積不正確 使用校準(zhǔn)過(guò)的移液器，快速、等量的將標(biāo)準(zhǔn)品分配到各個(gè)微孔中

　　高背景或陰性對(duì)照值偏高

可能原因 解決方法

陰性對(duì)照孔被陽(yáng)性對(duì)照或樣品污染 洗滌時(shí)，勿將洗液溢出孔外

抗體非特異性結(jié)合 封閉液不適合，更換封閉液

酶結(jié)合物過(guò)濃 請(qǐng)檢查酶結(jié)合物是否按說(shuō)明書規(guī)定稀釋

孵育溫度過(guò)高 檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定

底物在使用前曝光 應(yīng)保存在暗處，避光

讀板前停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 加終止液后3分鐘內(nèi)讀數(shù)

　　陽(yáng)性對(duì)照值偏低或低吸光度

可能原因 解決方法

試劑未平衡至室溫 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒從冰箱取出平衡至室溫

檢測(cè)體積偏小 檢查移液器吸液管道是否堵塞

孵育時(shí)間過(guò)短 使用計(jì)時(shí)器，準(zhǔn)確孵育時(shí)間

底物受污染 使用新配置的試劑，重新實(shí)驗(yàn)

包裝袋中有濕氣 檢查袋中是否有干燥劑

樣本中有抑制劑 疊氮鈉會(huì)抑制HRP酶的活性

　　邊緣效應(yīng)

可能原因 解決方法

蒸發(fā) 各步之間，須使用封版膠密封反應(yīng)板

溫度不均勻 校準(zhǔn)孵育箱，勿疊放反應(yīng)板

標(biāo)準(zhǔn)曲標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，但樣本無(wú)檢測(cè)信號(hào)

可能原因 解決方法

樣本中無(wú)檢測(cè)物或檢測(cè)物含量極低 設(shè)置內(nèi)參，重新實(shí)驗(yàn)

樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測(cè) 作適當(dāng)稀釋，降低其他物質(zhì)的干擾，或作系列稀釋，檢測(cè)回收率

樣本中檢測(cè)物濃度過(guò)高，Hook效應(yīng)導(dǎo)致假低值 適當(dāng)倍數(shù)稀釋樣本，檢測(cè)物濃度盡量在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)

　　重復(fù)性較差

可能原因 解決方法

微孔中有氣泡 用針尖挑破氣泡

試劑未混勻 確保充分混勻試劑

樣本中有雜質(zhì)或沉淀物 使用前離心

微孔包被面被吸頭劃破 加液時(shí)小心操作

使用用過(guò)的封板膠紙 每次須使用新的封板膠封住反應(yīng)孔

　　假陽(yáng)性反應(yīng)

可能原因 解決方法

洗滌不充分 使用前需檢查洗板機(jī)是否正常工作

洗板機(jī)管道堵塞 需經(jīng)常維護(hù)洗板機(jī)

加結(jié)合物時(shí)，灑在微孔邊緣 小心向微孔加入結(jié)合物，加入微孔底部中央，避免與孔壁和邊緣接觸

檢測(cè)樣本中含有紅細(xì)胞 離心

微孔中液體揮發(fā) 用封板膠密封反應(yīng)孔，置于濕盒內(nèi)

整塊板產(chǎn)生陽(yáng)性O(shè)D值或整個(gè)板顯藍(lán)色

可能原因 解決方法

洗滌液體積不足或底物被殘留于孔底的結(jié)合物所污染 洗滌時(shí)，緩沖液充滿至孔邊緣，但要確保不能溢出孔外

結(jié)合物濃度過(guò)高 檢查是否按照說(shuō)明書推薦比例稀釋

血清中有血清因子 勿加熱血清

底物容器不潔凈 用酸清洗容器瓶，用蒸餾水沖洗

底物孵育時(shí)，微孔板曝光 加底物時(shí)，立即將板置于暗處

　　整塊板OD值偏低

可能原因 解決方法

顯色時(shí)間不足 適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間

孵育溫度偏低 36度為最適反應(yīng)溫度

未加終止液 加入終止液，增強(qiáng)顏色反應(yīng)的強(qiáng)度，穩(wěn)定最終的顏色反應(yīng)

顯色緩慢

可能原因 解決方法

樣本未置于室溫 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將樣本平衡至室溫

酶結(jié)合物活性減弱 檢測(cè)稀釋度

酶活性收到抑制如疊氮鈉 避免實(shí)驗(yàn)不當(dāng)?shù)姆栏瘎?br />
顯色溫度不適當(dāng) 按說(shuō)明書操作

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